Technical Validation of a Next-generation Sequencing Assay for Detecting Clinically Relevant Levels of Breast Cancer-related Single-Nucleotide Variants and Copy Number Variants Using Simulated Cell-Free DNA
期刊：the Journal of Molecular Diagnostics
时间：2017.5.11
近日，国家卫生计生委临床检验中心李金明老师团队，为给国内外相关临床实验室提供一个ctDNA高通量测序（二代测序）方法如何做性能确认的示例，针对北京不朽情缘MG官网（Gene+）医学检验实验室研发的51个乳腺癌检测相关基因共计1005个外显子的ctDNA高通量测序检测方法，在研制模拟肿瘤游离DNA样本的基础上，进行了性能确认。该文章已于2017年5月11日在线发表于JMD（the Journal of Molecular Diagnostics）杂志。
设计采用HapMap NA12878细胞系提取DNA，通过OE-PCR 人工引入突变制备突变片段。突变片段与背景细胞系DNA以不同比例混合，片段化至170bp左右制备成游离DNA模拟样本，各样本突变含量经过dPCR验证确认后, 按所设计的性能确认方案，由北京不朽情缘MG官网（Gene+）医学检验实验室对样本进行双盲检测。突变片段包含6个SNV和2个CNV，详见下表：
性能确认内容：
1.测序质量和可报告范围确认
检测采用北京不朽情缘MG官网（Gene+）医学检验实验室乳腺癌检测基因盘，包含51个乳腺癌检测相关基因共计1005个外显子, 数据从样本水平、外显子水平及临床有效变异位点三个层面分析确认测序质量及可报告范围，并对人工制备的模拟cfDNA样本与真实的血浆cfDNA样本测序数据进行比较，结果显示二者在测序质量上非常相似，说明可以通过模拟cfDNA样本代替真实血浆样本进行检测性能确认。模拟样本与真实血浆样本的测序质量（包括探针靶向捕获性能等）对比如下图所示：
Comparison of plasma cell-free DNA (cfDNA) and mimic cfDNA quality metrics
A: Average on-target sequencing depth without duplicated reads (×). B: GC content (%). C: Fraction of on-target effective bases without duplicated reads (capture ef?ciency, %). D: Fraction of uniquely mapped on-target reads (%). E: Fraction of reads mapped to genome (mapping rate, %). F: Fraction of target coverage >30× (%). G: Fraction of target coverage >500× (%).
2.精密度
对于SNV，当突变含量≥0.5%时，批内一致性可达95.04%，批间一致性可达97.99%；；对于CNV，拷贝数≥1.259时，批内一致性达96.04%，批间一致性可达95.14%。另外对不同RUN不同批次检测结果与预期结果进行比较，结果也说明不同RUN的不同批次的检测结果均与预期结果相关性好，也可以反映该检测方法具有较高的精密度（如下图）：
3.准确度
对不同预期突变比例样本的检测结果显示，随着预期突变比例的增高，该方法的检测准确度也随之升高。对于SNV，当突变含量≥0.5%时，灵敏度达96.3%，特异度99.99%，准确度99.99%；对于CNV，当≥1.25 ×时，灵敏度达95.83%，特异度99.76%，准确度为99.76%（如选图所示）；
4.检测下限
对于SNV，当预期MAF分别为0.1%，≥0.3%，≥0.3%%和≥1%时，检测灵敏度分别为75.93%， 92.01%，96.30%和98.61%。而当CNV ≥ 1.25 ×时，检测灵敏度可达95.83%。因此从测试位点评估结果看，SNV突变含量≥0.5%，CNV≥1.25×时，检出率均≥95%，可满足临床特异性检测要求，故SNV的检测下限可至突变含量0.5%，CNV的检测下限可至1.25 ×。
5. 与数字PCR检测的一致性
对部分模拟cfDNA样本及血浆cfDNA样本均采用NGS及dPCR检测，结果显示两种检测平台一致性较好，阳性符合率、阴性符合率及总体符合率均超过了97%。二者结果相符性分析如下表：
6.多重测序验证
多重测序数据分析显示交叉污染错误率仅0.24%，低于检测下限，且支持交叉污染或错误的reads在数据分析的时候大部分会被过滤去除。
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